尼康新一代N-STORM 超分辨顯微成像系統(tǒng)

與N-STORM相比，N-STORM 4.0的圖像采集速度提高了10倍，使得活細胞納米級分辨率圖像的拍攝成為了可能。2015年3月15日，N-STORM 4.0在德國哥廷根的“聚焦顯微鏡”會議上首次亮相，并于3月底正式上市。
自從2010 年N-STORM發(fā)布以來，尼康在超分辨顯微鏡領(lǐng)域一直處于領(lǐng)先地位。N-STORM基于由哈佛大學(xué)霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所莊小威博士開發(fā)的隨機光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)，其原理是通過熒光分子的閃爍，暫時分離出單個的熒光分子并對其進行精確定位，從而重構(gòu)出納米級分辨率的圖像（分辨率是傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的10倍）。N-STORM 4.0作為N-STORM 的升級產(chǎn)品，實現(xiàn)了活細胞動態(tài)過程的超分辨成像。
2014年的諾貝爾化學(xué)獎授予了超分辨顯微鏡領(lǐng)域，這證明超分辨顯微鏡技術(shù)正得到越來越多的關(guān)注，與此同時，超分辨技術(shù)應(yīng)用擴展的需求也在增加。最新的研究表明，基于隨機光學(xué)重構(gòu)的超分辨技術(shù)實現(xiàn)了活細胞動態(tài)超分辨成像，前所未有的觀察到了細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的納米級動力學(xué)過程，如黏著斑1，網(wǎng)格蛋白小窩中的轉(zhuǎn)鐵蛋白簇2，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器3。
N-STORM 4.0 實現(xiàn)了激光激發(fā)設(shè)計和sCMOS相機的升級，單張圖像的采集速率從分鐘級提高到秒極。另外，新系統(tǒng)在成像視野的選擇上提供了更高的靈活性，用戶可以選擇活細胞高速成像模式，或者選擇固定細胞的大視野成像模式，以適應(yīng)不同的應(yīng)用需求。

1 Shroff, H. et al., 2008, Nature Methods, 5 (5), p417-423.
2 Jones, S.A. et al., 2011, Nature Methods, 8 (6), p499-505.
3 Shim, S-H. et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci., 109, p13978-13983. 

 ? 主要特點

 |  納米級水平的動態(tài)超分辨成像

    新升級的光學(xué)和照明系統(tǒng)，完美匹配sCMOS相機。
    圖像采集速度比N-STORM提升近10倍，單張圖像拍攝時間從分鐘級提高到秒級。
    活細胞動態(tài)超分辨成像，分辨率比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡提高10倍。

80umX80um（拍攝分辨率512X512），拍攝速度30Hz；

40umX40um（拍攝分辨率256X256），拍攝速度100Hz；

20umX20um(拍攝分辨率128X128)，拍攝速度500Hz。

  |  高質(zhì)量的超分辨成像 

     新升級的照明放大鏡提高了激光的激發(fā)效率，使得單位面積的熒光分子密度增加。
     采集足夠數(shù)量熒光分子所需時間更短，圖像采集速度顯著提高。
     單位時間內(nèi)采集到的熒光分子數(shù)更多，圖像清晰度顯著提高。

（左）用Alexa For For?647標(biāo)記的微管用N-STORM 4.0成像（具有20秒采集時間）

（右）與常規(guī)的N-STORM系統(tǒng)（20秒采集時間）相同的樣品成像

* Alexa For是Telo Fisher科學(xué)公司的注冊商標(biāo)。

 |   寬視野的超高分辨率成像

    新開發(fā)了成像系統(tǒng)中間變倍體，實現(xiàn)更大視野拍攝。
   80μm x 80μm大視野成像，成像區(qū)域是前一代N-STORM的4倍。

左：成像范圍寬4倍，80μm×80μm（寬視模式）      右：常規(guī)模型的成像面積，40μm×40μm

樣品：線粒體ToM20與AlEXA64 7結(jié)合

 |  多重漂移矯正機制

    1）自相關(guān)漂移矯正算法，可矯正XYZ三維方向上的位置漂移。

    2）以熒光小球或其他發(fā)光顆粒進行定位標(biāo)記參照，進行三維方向上的漂移矯正。

 |  N-STORM成像物鏡

    HP (High Power) 物鏡與高功率激光相匹配，使熒光基團發(fā)生快速閃爍。
    改進軸向色差校正，提高多色熒光的3D成像精度。

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超分辨率熒光顯微鏡技術(shù)大大的超出了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率極限

    N-STORM是一種超分辨率數(shù)字顯微鏡系統(tǒng)的新技術(shù)，該技術(shù)將“隨機光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)”（哈弗大學(xué)授權(quán)）與尼康的Eclipse Ti研究級倒置顯微鏡結(jié)合在了一起。N-STORM能夠顯著提高分辨率可達到傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨率的十倍或者更多，N-STORM可采集納米級的二維或三維多光譜圖像，橫向分辨率接近20nm軸向分辨率也接近50nm。N-STORM將光學(xué)顯微鏡的分辨能力延伸到了前所未有的分子水平。

遠大于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率

與傳統(tǒng)熒光顯微鏡不同，STORM并沒有在同一時間觀察樣品中所有的熒光標(biāo)記分子，在某一時間點她只是激活其中的一小部分。重復(fù)這一過程可獲得多張圖像，在這些圖像中分子以納米的精度定位，組合這些圖像將最終重構(gòu)出超級的分辨率。

 通過重疊單分子圖像構(gòu)建超分辨率的影像

“STORM”這一新技術(shù)是通過多次曝光進而運算得到熒光團的高精度定位信息，通過整合這些信息而重構(gòu)出高分辨率的熒光圖像（2D或3D）。這一技術(shù)可獲得更多豐富的細節(jié)信息，并更進一步使對樣品的理解從結(jié)構(gòu)水平進化到分子水平。

 以超高的分辨率獲取三維信息

“STORM”技術(shù)通過多次曝光可運算得到熒光團高精度的Z軸定位信息，對這些信息進行重構(gòu)即可獲得納米級分辨率的熒光3D圖像。正如單個分子可在x-y的維度中被定位一樣，N-STORM的3D組件同樣可在Z軸中確定單個分子的位置從而獲得高精度的3D超分辨率圖像。

 獨特的多色彩技術(shù)

采用不同有機染料的混合物可以實現(xiàn)多色彩的成像。這些染料是一種獨特的可以通過短波長激光活化而發(fā)光的熒光探針，通過不同波長的激光激發(fā)而成為彩色圖像：起始時這類探針處于非活化的狀態(tài)，隨后他們由一特殊波長的激發(fā)光激發(fā)而產(chǎn)生熒光。這一過程可使各個熒光團分別發(fā)光，從而相互區(qū)分開來，進而多次捕獲的圖像可以經(jīng)過編輯成為最終具有超高分辨率的圖像。

 簡單，靈活的配置

尼康已有的標(biāo)準(zhǔn)硬件配置讓N-STORM能最大程度的使用戶獲益。這也意味著超分辨率的能力可以添加到領(lǐng)導(dǎo)市場的尼康Ti-E倒置顯微鏡上面或者是新出品的A1R共聚焦顯微鏡系統(tǒng)上面使用，N-STORM可輕易的配合已有產(chǎn)品搭建多功能的系統(tǒng)